v
- Chạy PCR bằng cặp primer ITS4, ITS5 và cặp primer Elong R, Elong F trên 4
dòng
T
T
.
.
h
h
a
a
r
r
z
z
i
i
a
a
n
n
u
u
m
m
(
(
T
T
4
4
)
)
,
,
T
T
.
.
k
k
o
o
n
n
i
i
n
n
g
g
i
i
i
i
(
(
T
T
6
6
)
)
,
,
T
T
.
.
a
a
s
s
p
p
e
e
r
r
e
e
l
l
l
l
u
u
m
m
(
(
T
T
1
1
9
9
)
)
,
,
T
T
r
r
i
i
c
c
h
h
o
o
d
d
e
e
r
r
m
m
a
a
s
s
p
p
p
p
.
.
(
(
2
2
–
–
4
4
1
1
–
–
2
2
)
)
v
v
à
à
d
d
ò
ò
n
n
g
g
T
T
.
.
h
h
a
a
r
r
z
z
i
i
a
a
n
n
u
u
m
m
(
(
G
G
J
J
S
S
0
0
0
0
-
-
3
3
9
9
–
–
m
m
ẫ
ẫ
u
u
T
T
r
r
i
i
c
c
h
h
o
o
d
d
e
e
r
r
m
m
a
a
c
c
ủ
ủ
a
a
n
n
ư
ư
ớ
ớ
c
c
n
n
g
g
o
o
à
à
i
i
đ
đ
ã
ã
đ
đ
ư
ư
ợ
ợ
c
c
đ
đ
ị
ị
n
n
h
h
d
d
a
a
n
n
h
h
)
)
d
d
ù
ù
n
n
g
g
l
l
à
à
m
m
m
m
ẫ
ẫ
u
u
đ
đ
ố
ố
i
i
c
c
h
h
ứ
ứ
n
n
g
g
- Tiến hành khuếch đại vùng rDNA – ITS và vùng Tef với 2 cặp primer: ITS1-
ITS2 thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 670 bp (căn cứ trên thang
ladder), tƣơng tự nhƣ trên đối với cặp primer: ElongR, ElongF thu đƣợc sản phẩm
khuếch đại có kích thƣớc 260 bp (căn cứ trên thang ladder) trên 4 dòng
Trichoderma của Việt Nam và 1 dòng đối chứng của nƣớc ngoài Trichoderma
harzianum.
- Giải đƣợc trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và vùng Tef của dòng Trichoderma
harzianum (T4)
- So sánh trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 giữa dòng Trichoderma nghiên
cứu với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và dựa vào phần mềm
CLUSTALX.
Khẳng định T4: Trichoderma asperellum.
Kích thƣớc của vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 là 54 5bp.
Kích thƣớc vùng Tef là 223bp.
Trình tự nucleoted ở vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng Trichoderma
asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ
tƣơng đồng là 98%.
Trình tự nucleoted ở vùng Tef1fw – Tef2rev của dòng Trichoderma
asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ
tƣơng đồng 98%.
vi
MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách chữ viết tắt x
Danh sách các bảng và hình xi
PHẦN 1: GIỚI THIỆU VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma. 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Nguồn gốc 3
2.1.3 Đặc điểm hình thái 3
2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4
2.1.5 Cơ chế tác động của nấm trichoderma lên các nấm
gây bệnh cho cây trồng 5
2.1.6 Cơ chế đối kháng của trichoderma: 6
2.1.6.1 Kháng sinh 6
2.1.6.2 Ký sinh 7
2.1.6.3 Cạnh tranh 7
2.1.7 Ứng dụng của nấm Tricoderma trong các lĩnh vực 8
2.1.7.1 Lƣơng thực và nguyên liệu sợi 8
2.1.7.2 Chất sinh học 8
vii
2.1.7.3 Chất giúp tăng sự phát triển của cây 9
2.1.7.4 Nhƣ là nguồn trao đổi thông tin di truyền. 10
2.2 TỔNG QUAN VỀ ITS – rDNA 10
2.2.1 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS 10
2.2.2 Lịch sử nghiên cứu rDNA 12
2.2.3 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền 13
2.2.4 Nghiên cứu trên vùng rDNA-ITS và vùng Tef của nấm Trichoderma 13
2.3. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT PCR 14
2.3.1 Giới thiệu sơ lƣợc về phản ứng PCR 14
2.3.1.1 Khái niệm 15
2.3.1.2 Nguyên tắc 15
2.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng 17
2.3.2.1 DNA khuôn 17
2.3.2.2 Enzyme 17
2.3.2.3 Primer và nhiệt độ lai 17
2.3.2.4 Các thành phần khác trong phản ứng PCR 18
2.3.2.5 Số lƣợng chu kỳ phản ứng 18
2.3.2.6 Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 18
2.3.3 Ứng dụng của PCR 18
2.4. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT DNA SEQUENCING 20
2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC 21
2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THẾ GIỚI 22
2.7 HƢỚNG PHÁT TRIỂN TƢƠNG LAI TRÊN CÁC DÕNG
NẤMTRICHODERMA (HARMAN 2000) 22
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 24
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24
3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 24
viii
3.2 HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM. 26
3.2.1 Hóa chất 26
3.2.1.1 Môi trƣờng để lƣu trữ nguồn nấm 26
3.2.1.2 Môi trƣờng để phục hồi nhanh dòng nấm 26
3.2.1.3 Hoá chất cần cho dung dịch nhân sinh khối nấm 26
3.2.1.4 Hoá chất cần cho tách chiết DNA sợi nấm 26
3.2.1.5 Hoá chất sử dụng trong điện di 27
3.2.1.6 Hoá chất cho phản ứng PCR 27
3.2.1.7 Hoá chất trong tinh sạch sản phẩm PCR 27
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27
3.3 PHỤC HỒI CÁC DÕNG NẤM TRICHODERMA 28
3.4 NHÂN SINH VÀ THU SINH KHỐI NẤM. 28
3.5 LY TRÍCH DNA TỪ NẤM ĐÃ ĐƢỢC NGHIỀN MỊN. 29
3.6 KIỂM TRA KẾT QUẢ LY TRÍCH DNA VÀ PHA LOÃNG DNA 30
3.7 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI VÙNG ITS-rDNA, TEF
CÁC DÕNG NẤM TRICHODERMA. 31
3.7.1 Vật liệu và thành phần hoá chất cho phản ứng PCR 31
3.7.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (Wang C. Z., 2002). 33
3.7.3 Đánh giá kết quả PCR 33
3.8 ĐỌC TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR 35
3.8.1 Chuẩn bị DNA khuôn 35
3.8.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 35
3.8.1.2 Định lƣợng sản phẩm PCR đã tinh sạch 38
3.8.2 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 38
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phục hồi nấm Trichoderma từ những ống nghiệm chứa những bào tử
nấm 39
4.2. Kết quả ly trích thu DNA từ các dòng nấm Trichoderma 40
ix
4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 41
4.4 Pha loãng sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch 42
4.5 Sản phẩm PCR tinh sạch của dòng Trichoderma harzianum 43
4.6 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA và vùng Tef 43
4.6.1 So sánh trình tự nucleotid giữa vùng ITS – rDNA và vùng Tef 43
4.6.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 48
4.6.3 Kết quả giải trình tự vùng Tef1fw – Tef2rev của dòng T4 50
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận 51
5.2 Đề nghị 52
5.3 Hạn chế đề tài 52
Tài liệu tham khảo 53
Phụ lục 55
x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
dNTP: 2’ – dideoxynucleotide – 5’ – triphosphate.
dATP: 2’ – dideoxyadenine – 5’ – triphosphate.
dCTP: 2’ – dideoxycytosine – 5’ – triphosphate.
dGTP: 2’ – dideoxyguanine – 5’ – triphosphate.
dTTP: 2’ – dideoxyadenine – 5’ – triphosphate.
EDTA: Ethylene Diamin Tetracetic Acid.
ETS: External Transcribed Spacer.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
LSU: Large Subunit.
NCBI: National Center for Biotechnology Informatic.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
rDNA: ribosomal DNA.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
RNA: Ribonucleic acid.
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism.
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate.
SSU: Small Subunit.
Taq: Thermus aquaticus
TAE: Tricacetic ethylene diamine tetra acetate.
TE: Tris ethylene diamine tetra acetate.
Tm: Melting Tempereture.
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG
Hình 2.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử 4
Hình 2.2 Sợi nấm phát triển trên môi trƣờng PDA 4
Hình 2.3 Hệ sợi nấm Trichoderma trên khuẩn ty nấm Rhizoctonia Solani 5
Hình 2.4 Sợi nấm Trichoderma ăn mòn vách tế bào và tạo nên
lổ hỗng trên sợi nấm Rhizoctonia Solani 5
Hình 2.5 Trichoderma ký sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu 6
Hình 2.6 Sự xâm chiếm của vi khuẩn gây bệnh lên rễ cây bắp
và tiêu diệt vi khuẩn của Trichoderma 6
Hình 2.7 Sự tăng trƣởng của bộ rễ cây họ đậu khi xử lý
nấm Trichoderma và khi không sử dụng 9
Hình 2.8 Sự gia tăng sản lƣợng và phát triển của cây trồng
có xử lý Trichoderma dòng T22 9
Hình 2.9 Sơ đồ vùng rDNA – ITS của nấm 11
Hình 3.1. Ứng dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại
trình tự đoạn gene tef1fw – tef2rev 31
Hình 3.2 Quy trình khuếch đại vùng ITS – rDNA bằng primer
ITS4 và ITS5, Elong R và Elong F 34
Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR 38
Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA tổng số từ các dòng Trichoderma 40
Hình 4.2 DNA tổng số đƣợc pha loãng trƣớc khi chạy PCR 41
Hình 4.3 Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer Elong R – Elong F 42
Hình 4.4 Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ITS4 và ITS5 42
Hình 4.5 Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch trƣớc khi đọc trình tự DNA 43
Bảng 4.1: Các nguồn nấm Trichoderma trên genebank
đƣợc dùng để so sánh vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 44
Bảng 5.2 Các nguồn nấm Trichoderma trên genebank
đƣợc dùng để so sánh vùng Tef 47
1
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay những vấn nạn về môi trƣờng sinh thái, môi trƣờng sống của con
ngƣời vật nuôi cũng nhƣ những vấn đề về an toàn thực phẩm và sức khoẻ cộng đồng
ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn, khi mà những ca cấp cứu vì ngộ độc do ăn phải
rau quả chứa dƣ lƣợng thuốc trừ sâu và thuốc kích thích sinh trƣởng ngày một tăng
lên.
Công nghệ hoá học phát triển kéo theo việc sản xuất hàng loạt thuốc bảo vệ
thực vật từ các loại hoá chất tổng hợp. Chúng ta không thể phủ nhận khả năng diệt trừ
sâu bệnh, côn trùng, nấm, vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng của những sản phẩm
thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hoá học là rất nhanh và hiệu quả. Thuốc kích
thích sinh trƣởng có nguồn gốc hoá học cũng tác động nhanh chóng lên sự sinh trƣởng
của: củ, quả, thân, lá cây trồng. Nhƣng hệ lụy của thuốc bảo vệ thực vật và thuốc
kích thích sinh trƣởng có nguồn gốc hóa học đó là sự tàn phá nhanh chóng môi trƣờng
sinh, gây tình trạng ô nhiễm đất đai, nguồn nƣớc và cả không khí, từ đó gây hại cho
sức khoẻ cho con ngƣời và vật nuôi, tiêu diệt cả những loài thiên địch có lợi cho đất
đai và cây trồng, làm phá vỡ cân bằng sinh thái giữa các giống loài, gây tình trạng ngộ
độc có thể dẫn đến chết ngƣời.
Hơn thế nữa, xu hƣớng của thời đại đòi hỏi nghiêm ngặc hơn những chỉ tiêu
về an toàn thực phẩm nói chung và an toàn khi sử dụng rau quả nói riêng. Vì thế cần
phải tìm ra những giải pháp vừa giải quyết những vấn đề sau: một là: vấn nạn về môi
do những loại thuốc hoá học rồi sẽ tác hại ngày một nhiều hơn đến môi sinh và sức
khoẻ cộng đồng; hai là: để đảm bảo chỉ tiêu an toàn cho môi trƣờng sống; ba là: tìm
đầu ra cho nông sản Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách, khi Việt Nam gia nhập
WTO.
Vì vậy hƣớng phát triển nông nghiệp bền vững là giải pháp tối ƣu để giải
quyết những vấn đề nêu trên. Bƣớc đầu tiên là cần thay dần thuốc bảo vệ thực vật có
2
nguồn gốc hoá học sang việc dùng những chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Nấm
Tricoderma là loại nấm đối kháng mạnh, có phổ đối kháng rộng lớn đối với các loại
nấm gây bệnh và sâu bệnh hại cây trồng. Ngoài ra, nấm Tricoderma còn có khả năng
kích thích sự phát triển của bộ rễ cây trồng khi có xử lý Trichoderma; vì thế nấm
Tricoderma trở thành nguồn sinh vật tự nhiên hữu ích và hiệu quả trong việc tạo ra
những chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh cho cây trồng và những sản phẩm kích
thích sự phát triển của bộ rễ nhờ vào khả năng loại bỏ mầm bệnh ở bộ rễ cây của nấm
Tricoderma giúp cho cây khoẻ mạnh hơn thì khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng của
cây cũng tối ƣu hơn.
Tuy nhiên những nghiên cứu về hình thái học, về các phản ứng sinh hoá hay
qua phƣơng pháp tuyển chọn các dòng nấm theo phƣơng pháp cổ điển cần thời gian
dài mà kết quả không chính xác. Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh
học và sinh học phân tử với nhiều kỹ thuật hiện đại nhƣ PCR, RFLP, AFLP, RAPD
đã đƣợc xem nhƣ công cụ hữu ích vì thời gian tiến hành thí nghiệm cho đến lúc cho ra
kết quả cần thời gian ngắn , chính xác trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền, biểu
hiện của gen liên quan đến cơ chế tác động của sinh vật.
1.2 Mục đích nghiên cứu
Khuếch đại vùng gen ITS – rDNA và vùng Tef các nguồn nấm Trichodema từ
đó giải trình tự đoạn DNA khuếch đại, định danh các dòng nấm Trichoderma.spp.
1.3 Yêu cầu
- Phục hồi các dòng nấm Trichoderma từ những ống nghiệm chứa bào tử.
- Nuôi cấy và nhân sinh khối các dòng nấm.
- Thu sinh khối và nghiền mẫu nấm.
- Ly trích DNA của các dòng nấm.
- Thực hiện quy trình PCR: khuếch đại vùng gen ITS1 – 5,8 S – ITS2 và vùng
Tef1fw – Tef2rev của các dòng nấm Trichoderma.
- Đọc trình tự vùng gen ITS1 – 5,8 S – ITS2 và vùng Tef1fw – Tef2rev trực tiếp
từ sản phẩm PCR và so sánh các thông tin từ cơ sở dữ liệu NCBI để đối chiếu
xác định tên loài.
3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma
2.1.1 Phân loại
Giới : Fungi
Ngành : Ascomycota
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypocreacea
Giống: Trichoderma
2.1.2 Nguồn gốc
Trichoderma là một loại nấm đất. Chúng đƣợc tìm thấy khắp mọi nơi trừ
những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderme phổ biến trong những khu rừng
nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng trên rễ cây, trong đất hay sống trên xác sinh vật
đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên những loại nấm khác. Mỗi dòng nấm
Trichoderme spp. khác nhau sẽ yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E.
Harman 2000).
Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 3,5 cho đến 7 nhƣng không thể
phát triển trong điều kiện pH nhỏ hơn 3,5, phát triển tốt ở độ pH trung tính.
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Trichoderma là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ
Khuẩn ty: Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh
nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có
vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào
tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục
trắng đến màu lục, vàng, xanh. Các chủng nấm Trichoderma phát triển rất nhanh,
chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ( Bùi Xuân
Đồng, 1982. Nhóm nấm Hyphomytes ở Việt Nam. Tập I. Nhà xuất bản Khoa học và
kỹ thuật, Hà Nội).
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét