Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi băng

iv
TÓM TẮT
TRẦN THỊ MINH TÚ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY
DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY
BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ”.

Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là vi khuẩn Xanthomonas spp. Đây là vi
khẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hƣởng rất lớn đến
năng suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật nông học, phƣơng pháp sinh
học phân tử nhằm định danh dòng Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây bƣởi mục
tiêu hiểu rõ bản chất sinh học của dòng gây bệnh, để dễ dàng cho việc đƣa ra các biện
pháp phòng trừ bệnh do vi khuẩn này gây ra. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thực tập
Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông
Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 06/02/06 đến 06/08/06.
Nội dung nghiên cứu:
1. Phân lập, nuôi cấy, xác định gram, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC.
2. Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn
phân lập đƣợc.
3. Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trƣng để nhận Xanthomonas sp. .
4. Tiến hành nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số.
5. Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và
Xan332.
6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và
XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri.








v
Kết quả đạt đƣợc:
1. Phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trƣờng YDC phân
thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh
2. Tất cả 4 dòng phân lập đƣợc đều tạo vết thƣơng sau khi chủng bệnh nhân tạo,
triệu chứng bệnh có khác nhau.
3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV.
4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer
Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb.
5. Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên
biệt XACR và XACF.























vi
MỤC LỤC
TRANG
Trang bìa
Trang tựa
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các hình viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các chữ viết tắt xi
Phần 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 1
1.3. Yêu cầu 2
1.4. Giới hạn của đề tài 2

Phần 2. TỔNG QUAN 3
2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi 3
2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc 3
2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam 4
2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới 4
2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) 5
2.2.1. Triệu chứng bệnh 5
2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) 7
2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS 8





vii
2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA 8
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. 9
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen 9
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 11
2.5.1. Trên Thế Giới 11
2.5.2. Tại Việt Nam 12
2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . 12
2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp
nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 12
2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử 13
2.7 Phƣơng pháp PCR 13
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.2. Nội dung nghiên cứu 16
3.3 Vật liệu nghiên cứu 16
3.4. Phƣơng pháp tiến hành 17
3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định
Gram âm hay Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi 17
3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo 18
3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn 18
3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 20
3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen 21
3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập
với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22
3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập
với cặp mồi XACF và XACR 23
3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR 23





viii
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở
cây bƣởi da láng và bƣởi đƣờng cam 25
4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC 25
4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo 26
4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh 28
4.4 Ly trích DNA tổng số 28
4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS 29
4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen 29
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1. Kết luận 32
5.2. Đề nghị 32
Phần 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
Phần 7. PHỤ LỤC 35

















ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng 6
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng 6
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh loét trên cành bƣởi Da Láng 7
Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS trên Xanthomonas ssp 10
Hình 2.5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng Xanthomonas ssp.
dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS 10
Hình 3.1(a) Tấm sắc ký vừa nhỏ dung dịch sắc tố 19
Hình 3.1(b). Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm 19
Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA
nhiệt độ 28
o
C 25
Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở
nhiệt độ 28
o
C 26
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng bốn dòng phân lập đƣợc trên lá non
bƣởi Da Láng quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đai 4x10 lần 27
Hình 4.4. Kết quả sắc ký trƣớc 28
Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.2.4.4 29
Hình 4.6. Kết quả diện di sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi
Xan1330 và Xan332 29
Hình 4.7. Sơ đồ các bƣớc cơ bản định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi theo
phƣơng pháp sinh học phân tử 31









x
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang
Bảng 2.1. Môi trƣờng phân lập một số loài X. campestis 14
Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa Xanthomonas sp. 14
Bảng 3.3.Thành phần dung dịch đệm TE 20
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồiXan1330 và Xan332 22
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi XACF và XACR 23
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt phản ứng với cặp mồi XACF và XACR 23
Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn đƣợc phân lập từ bƣởi Da Láng
và bƣởi Đƣờng Cam 25
Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng
XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 27










xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ITS : Internal Transcribed Spacer – vùng dịch mã trong nhân
DNA : Deoxyribonucleotide Acid
rDNA : ribosome DNA
PCR : Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi Polymerase
PGA : Potato Glucose Agar
STT : Số thứ tự
ng : nano gram
µM : micro mol
TE : Tris EDTA
µg : micro gram
µl : micro lit
TAE : Tris Acetic EDTA
bp : base pair
dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate
ISGs : intraspecific groups
SDS : sodium dodecyl sulfate
EDTA : ethylenediamine – tetraacetic acid
IGS : intergenic spacer





1




Phần 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho nhiều loại
cây nhiệt đới phát triển. Đặc biệt các loại cây ăn quả rất đa dạng và phong phú về
chủng loại. Trong đó bƣởi (Citrus grandis L Rutaceae) là loại cây ăn quả thuộc nhóm
cây có múi đƣợc trồng phổ biến và lâu đời tại các vùng đông Nam Bộ với các vùng
trồng bƣởi lâu đời và nổi tiếng nhƣ Vĩnh Cửu (Đồng Nai), Tân Uyên (Bình Dƣơng).
Cây bƣởi có tuổi thọ lâu hơn các loại cây có múi khác, thời gian bảo quản cũng lâu
hơn. Bƣởi còn là loại quả giàu vitamin đƣợc thị trƣờng trong nƣớc cũng nhƣ ngoài
nƣớc ƣa chuộng về hƣơng vị cũng nhƣ dinh dƣỡng nên ngƣời trồng bƣởi có thu nhập
cao và ổn định hơn so với các loại cây nông nghiệp khác. Vì vậy, cây bƣởi đã góp
phần cải thiện và nâng cao đời sống của ngƣời dân.
Tuy nhiên cho đến nay diện tích trồng bƣởi không tăng. Mặt khác, giống bƣởi
năng suất và phẩm chất rất tốt là cây Bƣởi Đƣờng Da Láng lại giảm rõ rệt. Nguyên
nhân chính là do bị nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây nên.
Vi khuẩn không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng quả nhƣng gây nên những vết sần sùi
trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng. Ngoài ra, vi
khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
cây. Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại hầu hết
các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng.
Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng
pháp sinh học phân tử”. Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị
bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả
kinh tế cao.
1.2. Mục đích
- Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây
bƣởi).
- Phân loại tính độc của chủng gây bệnh.
2




1.3. Yêu cầu
- Thành thạo các thao tác phân lập, nuôi cấy, chủng bệnh nhân tạo trong phòng
thí nghiệm.
- Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn.
- Thành thạo phƣơng pháp ly trích DNA vi khuẩn.
- Tính toán, thiết lập đƣợc phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm.
1.4. Giới hạn của đề tài
- Chỉ xác định đƣợc chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng,
bƣởi Đƣờng Cam là Xanthomonas sp.
- Chƣa giải đƣợc trình tự sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS, chƣa thực
hiện đƣợc phản ứng PCR trên hrpW để định danh chính xác chủng vi khuẩn
gây bệnh ở mức độ loài.

Xem chi tiết: Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi băng